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磁性酸化鉄ナノ粒子の動きを制御し、細胞増殖抑制剤を標的部位に送達する
著者 トロポワ Y、コロレフ D、イストミナ M、シュルマイスター G、ペトゥホフ A、ミシャニン V、ゴルシコフ A、ポジャチェヴァ E、ガレーエフ K、バグロフ A、デミドフ O
1 Yana Toropova,1 Dmitry Korolev,1 Maria Istomina,1,2 Galina Shulmeyster,1 Alexey Petukhov,1,3 Vladimir Mishanin,1 Andrey Gorshkov,4 Ekaterina Podyacheva,1 Kamil Gareev,2 Alexei Bagrov,5 Oleg Demidov6,71ロシア連邦保健省アルマゾフ国立医学研究センター、サンクトペテルブルク、197341、ロシア連邦; 2 サンクトペテルブルク電気工科大学「LETI」、サンクトペテルブルク、197376、ロシア連邦; 3 ロシア連邦保健省アルマゾフ国立医学研究センター個別化医療センター、サンクトペテルブルク、197341、ロシア連邦; 4 ロシア連邦保健省「AA Smorodintsev 記念インフルエンザ研究所」FSBI、サンクトペテルブルク、ロシア連邦; 5 セチェノフ進化生理学・生化学研究所、ロシア科学アカデミー、サンクトペテルブルク、ロシア連邦; 6 ロシア科学アカデミー細胞学研究所、サンクトペテルブルク、194064、ロシア連邦; 7 INSERM U1231、ブルゴーニュ・フランシュ・コンテ大学ディジョン校医学・薬学部、フランス 連絡先: Yana Toropova アルマゾフ国立医学研究センター、ロシア連邦保健省、サンクトペテルブルク、197341、ロシア連邦 電話 +7 981 95264800 4997069 メール [email protected] 背景: 細胞静止毒性の問題に対する有望なアプローチは、標的薬物送達のための磁性ナノ粒子 (MNP) の使用です。目的: 計算を用いて、生体内で MNP を制御する磁場の最適な特性を決定し、in vitro および in vivo でマウス腫瘍への MNP のマグネトロン送達の効率を評価する。(MNPs-ICG) が使用される。腫瘍マウスで、関心部位に磁場がある場合とない場合の両方で、生体内発光強度研究が実施された。これらの研究は、ロシア保健省アルマゾフ国立医学研究センター実験医学研究所によって開発された流体力学的足場上で実施された。結果: ネオジム磁石の使用は、MNP の選択的蓄積を促進した。腫瘍を有するマウスに MNPs-ICG を投与してから 1 分後、MNPs-ICG は主に肝臓に蓄積した。磁場の有無にかかわらず、これはその代謝経路を示している。磁場が存在する場合、腫瘍内の蛍光の増加が観察されたが、動物の肝臓内の蛍光強度は時間の経過とともに変化しなかった。結論：このタイプのMNPは、計算された磁場強度と組み合わせることで、腫瘍組織への細胞増殖抑制剤の磁気制御送達の開発の基礎となり得る。キーワード：蛍光分析、インドシアニン、酸化鉄ナノ粒子、細胞増殖抑制剤のマグネトロン送達、腫瘍ターゲティング
腫瘍疾患は世界中で主要な死因の一つです。同時に、腫瘍疾患の罹患率と死亡率の増加傾向は依然として続いています。1 現在使用されている化学療法は、さまざまな腫瘍に対する主要な治療法の一つです。同時に、細胞増殖抑制剤の全身毒性を軽減する方法の開発は依然として重要です。毒性の問題を解決するための有望な方法は、ナノスケールキャリアを使用して標的薬物送達方法を使用することです。これにより、健康な臓器や組織への薬物蓄積濃度を増加させることなく、腫瘍組織に局所的に薬物を蓄積させることができます。2 この方法により、化学療法薬の腫瘍組織への効率と標的化を向上させながら、全身毒性を軽減することが可能になります。
細胞増殖抑制剤の標的送達に検討されている様々なナノ粒子の中でも、磁性ナノ粒子（MNP）は、その独自の化学的、生物学的、および磁気的特性により、特に注目されています。これらの特性により、磁性ナノ粒子は多用途性を確保しています。そのため、磁性ナノ粒子は、温熱療法（磁気温熱療法）による腫瘍治療のための加熱システムとして使用できます。また、診断剤（磁気共鳴診断）としても使用できます。3-5 これらの特性と、外部磁場の使用による特定の領域へのMNPの蓄積の可能性を組み合わせることで、標的型医薬品の送達は、腫瘍部位に細胞増殖抑制剤を標的とする多機能マグネトロンシステムの構築を可能にします。展望。このようなシステムは、MNPと、体内での動きを制御するための磁場を含みます。この場合、外部磁場と、腫瘍を含む身体領域に配置された磁気インプラントの両方を磁場源として使用できます。6 最初の方法には、薬剤の磁気標的化のための特殊な装置の使用や、手術を行う人員の訓練が必要であるなど、深刻な欠点があります。さらに、この方法は高コストという制約があり、体表面に近い「表在性」腫瘍にしか適していません。磁気インプラントを使用する代替方法は、この技術の適用範囲を拡大し、体のさまざまな部位にある腫瘍への使用を容易にします。個々の磁石と管腔内ステントに組み込まれた磁石の両方を、中空臓器の腫瘍損傷に対するインプラントとして使用して、その開存性を確保することができます。しかし、我々の未発表の研究によると、これらは血流からMNPを保持するのに十分な磁性を持っていません。
マグネトロンを用いた薬剤送達の有効性は、磁性担体自体の特性、磁場源の特性（永久磁石の幾何学的パラメータや発生する磁場の強度など）といった多くの要因に依存します。磁気誘導型細胞阻害剤送達技術を成功させるには、適切な磁性ナノスケール薬剤担体の開発、その安全性の評価、そして体内での動きを追跡できる可視化プロトコルの開発が必要です。
本研究では、体内における磁性ナノスケール薬剤キャリアを制御するための最適な磁場特性を数学的に算出しました。また、これらの計算特性を持つ磁場を印加した際に、単離したラット血管を用いて、MNPが血管壁を通過する可能性についても検討しました。さらに、MNPと蛍光剤の複合体を合成し、生体内での可視化プロトコルを開発しました。生体内条件下、腫瘍モデルマウスにおいて、磁場を印加した状態で全身投与した場合の、腫瘍組織におけるMNPの蓄積効率を検討しました。
試験管内試験では参照MNPを使用し、生体内試験では蛍光剤（インドールシアニン；ICG）を含む乳酸ポリエステル（ポリ乳酸、PLA）でコーティングしたMNPを使用した。MNP-ICGは、この場合（MNP-PLA-EDA-ICG）として使用される。
MNPの合成方法、物理的および化学的性質については、他の文献で詳細に説明されている。7,8
MNPs-ICGを合成するために、まずPLA-ICG複合体を作製した。分子量60 kDaのPLA-DとPLA-Lの粉末ラセミ混合物を使用した。
PLAとICGはどちらも酸であるため、PLA-ICG複合体を合成するには、まずPLA上にアミノ末端スペーサーを合成する必要があります。これにより、ICGがスペーサーに化学吸着しやすくなります。スペーサーは、エチレンジアミン（EDA）、カルボジイミド法、水溶性カルボジイミドである1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDAC）を使用して合成しました。PLA-EDAスペーサーは次のように合成します。2 mLの0.1 g/mL PLAクロロホルム溶液に、20倍モル過剰のEDAと20倍モル過剰のEDACを加えます。合成は、15 mLポリプロピレン試験管で、300 min-1の速度で2時間振とうして行いました。合成スキームを図1に示します。合成スキームを最適化するために、試薬を200倍過剰にして合成を繰り返します。
合成終了後、溶液を3000 min⁻¹の速度で5分間遠心分離し、沈殿した過剰なポリエチレン誘導体を除去した。次に、ジメチルスルホキシド（DMSO）中の0.5 mg/mL ICG溶液2 mLを2 mLの溶液に加えた。撹拌機を300 min⁻¹の速度で2時間撹拌した。得られた複合体の概略図を図2に示す。
200 mgのMNPに、4 mLのPLA-EDA-ICG複合体を加えた。LS-220シェーカー（LOIP、ロシア）を使用して、懸濁液を300 min-1の周波数で30分間撹拌した。次に、イソプロパノールで3回洗浄し、磁気分離を行った。UZD-2超音波分散装置（FSUE NII TVCH、ロシア）を使用して、連続超音波作用下で5～10分間、懸濁液にIPAを加えた。3回目のIPA洗浄後、沈殿物を蒸留水で洗浄し、生理食塩水に2 mg/mLの濃度で再懸濁した。
得られたMNPの水溶液中におけるサイズ分布を調べるために、ZetaSizer Ultra装置（Malvern Instruments社、英国）を使用した。MNPの形状とサイズを調べるために、JEM-1400 STEM電界放出型カソードを備えた透過型電子顕微鏡（TEM）（日本電子、日本）を使用した。
本研究では、円筒形の永久磁石（N35グレード、ニッケル保護コーティング付き）を使用し、標準サイズ（長軸の長さ×円筒の直径）は0.5×2 mm、2×2 mm、3×2 mm、5×2 mmです。
モデルシステムにおける MNP 輸送の in vitro 研究は、ロシア保健省アルマゾフ国立医学研究センター実験医学研究所が開発した流体力学的足場上で実施された。循環液 (蒸留水またはクレブス・ヘンゼライト溶液) の容量は 225 mL である。軸方向に磁化された円筒形磁石を永久磁石として使用する。磁石を中央ガラス管の内壁から 1.5 mm 離れたホルダーに置き、その端を管の方向 (垂直) に向ける。閉ループ内の流体流量は 60 L/h (線速度 0.225 m/s に相当) である。クレブス・ヘンゼライト溶液は血漿の類似物であるため、循環液として使用される。血漿の動粘度係数は 1.1～1.3 mPa∙s である。9 磁場に吸着された MNP の量は、実験後の循環液中の鉄の濃度から分光光度法によって決定される。
さらに、改良された流体力学テーブルで実験的研究を行い、血管の相対透過率を決定しました。流体力学的サポートの主要コンポーネントを図 3 に示します。流体力学的ステントの主要コンポーネントは、モデル血管系の断面をシミュレートする閉ループと貯蔵タンクです。モデル流体の血管モジュールの輪郭に沿った移動は、蠕動ポンプによって行われます。実験中は、蒸発と必要な温度範囲を維持し、システムパラメータ (温度、圧力、液体流量、および pH 値) を監視します。
図3 頸動脈壁の透過性を研究するために使用した装置のブロック図。1-貯蔵タンク、2-蠕動ポンプ、3-MNPを含む懸濁液をループに導入する機構、4-流量計、5-ループ内の圧力センサー、6-熱交換器、7-容器付きチャンバー、8-磁場源、9-炭化水素入りバルーン。
容器を収容するチャンバーは、外側の大きな容器と、中央回路のアームが通る2つの小さな容器の3つの容器から構成されています。カニューレは小さな容器に挿入され、容器は小さな容器に紐で固定され、カニューレの先端は細いワイヤーでしっかりと結ばれます。大きな容器と小さな容器の間の空間は蒸留水で満たされ、熱交換器との接続により温度は一定に保たれます。小さな容器内の空間は、血管細胞の生存能力を維持するためにクレブス・ヘンゼライト溶液で満たされています。タンクにもクレブス・ヘンゼライト溶液が満たされています。ガス（炭素）供給システムは、貯蔵タンク内および容器を収容するチャンバー内の小さな容器内の溶液を気化させるために使用されます（図4）。
図4 容器が配置されるチャンバー。1-血管を下げるためのカニューレ、2-外側チャンバー、3-小型チャンバー。矢印はモデル流体の流れ方向を示します。
血管壁の相対透過性指数を測定するために、ラットの頸動脈を用いた。
MNP懸濁液（0.5mL）をシステムに導入する際の特性は以下のとおりです。ループ内のタンクと接続パイプの総内部容積は20mL、各チャンバーの内部容積は120mLです。外部磁場源は、標準サイズ2×3mmの永久磁石です。これは、小型チャンバーの1つの上部、容器から1cm離れた位置に設置され、片方の端が容器の壁に面しています。温度は37℃に保たれています。ローラーポンプの出力は50%に設定されており、これは17cm/sの速度に相当します。対照として、永久磁石のないセルでサンプルを採取しました。
所定濃度のMNPを投与してから1時間後、チャンバーから液体サンプルを採取した。粒子濃度は、Unico 2802S UV-Vis分光光度計（United Products & Instruments社製、米国）を用いて分光光度計で測定した。MNP懸濁液の吸収スペクトルを考慮し、測定は450 nmで行った。
Rus-LASA-FELASAガイドラインに従い、すべての動物は特定病原体フリー施設で飼育されました。本研究は、動物実験および研究に関するすべての関連倫理規定を遵守しており、アルマゾフ国立医学研究センター（IACUC）から倫理的承認を得ています。動物は水を自由に摂取し、定期的に餌を与えられました。
本研究は、麻酔をかけた生後12週齢の雄性免疫不全NSGマウス（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj、Jackson Laboratory、米国）10匹（体重22g±10%）を用いて実施した。免疫不全マウスは免疫が抑制されているため、この系統の免疫不全マウスでは、移植拒絶反応を起こすことなくヒト細胞や組織の移植が可能である。異なるケージの同腹仔をランダムに実験群に割り当て、共通の微生物叢への均等な曝露を確保するため、他の群の敷料に同居または系統的に曝露させた。
HeLaヒト癌細胞株は、異種移植モデルを確立するために使用された。細胞は、10%ウシ胎児血清（Hyclone、米国）、100 CFU/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを添加したグルタミン含有DMEM（PanEco、ロシア）で培養された。この細胞株は、ロシア科学アカデミー細胞研究所遺伝子発現制御研究室から提供された。注射前に、HeLa細胞は1:1トリプシン：ベルセン溶液（Biolot、ロシア）で培養プラスチックから除去された。洗浄後、細胞は完全培地に200 μLあたり5×10⁶個の濃度で懸濁され、基底膜マトリックス（LDEV-FREE、MATRIGEL® CORNING®）で1:1に希釈された（氷上）。調製した細胞懸濁液は、マウスの大腿部の皮下に注射された。電子ノギスを使用して、3日ごとに腫瘍の成長をモニタリングしてください。
腫瘍が500 mm3に達した時点で、実験動物の腫瘍近傍の筋肉組織に永久磁石を埋め込んだ。実験群（MNPs-ICG + tumour-M）では、0.1 mLのMNP懸濁液を注入し、磁場に曝露した。未処置の動物を対照群（バックグラウンド）として用いた。さらに、0.1 mLのMNPを注入したが磁石を埋め込まなかった動物（MNPs-ICG + tumor-BM）も用いた。
生体内および生体外サンプルの蛍光可視化は、IVIS Lumina LTシリーズIIIバイオイメージャー（PerkinElmer Inc.、米国）を用いて行った。生体外可視化では、合成PLA-EDA-ICGおよびMNP-PLA-EDA-ICG複合体1 mLをプレートウェルに添加した。ICG色素の蛍光特性を考慮し、サンプルの発光強度を決定するために最適なフィルターを選択した。最大励起波長は745 nm、発光波長は815 nmである。Living Image 4.5.5ソフトウェア（PerkinElmer Inc.）を用いて、複合体を含むウェルの蛍光強度を定量的に測定した。
MNP-PLA-EDA-ICG複合体の蛍光強度と蓄積は、対象部位に磁場を印加せずに、生体内の腫瘍モデルマウスで測定されました。マウスはイソフルランで麻酔され、その後、0.1 mLのMNP-PLA-EDA-ICG複合体が尾静脈から注射されました。未処理のマウスは、蛍光バックグラウンドを得るためのネガティブコントロールとして使用されました。複合体を静脈内投与した後、2%イソフルラン麻酔を維持しながら、動物をIVIS Lumina LTシリーズIII蛍光イメージャー（PerkinElmer Inc.）のチャンバー内の加熱ステージ（37℃）に置きます。MNP導入後1分と15分に、ICGの内蔵フィルター（745～815 nm）を使用して信号を検出します。
腫瘍における複合体の蓄積を評価するために、動物の腹膜領域を紙で覆い、肝臓における粒子の蓄積に伴う強い蛍光を排除できるようにした。MNP-PLA-EDA-ICGの生体内分布を研究した後、動物はイソフルラン麻酔の過剰投与により人道的に安楽死させ、その後、腫瘍領域を分離し、蛍光放射を定量的に評価した。Living Image 4.5.5ソフトウェア（PerkinElmer Inc.）を使用して、選択した関心領域からの信号解析を手動で処理した。各動物（n = 9）について3回の測定を行った。
本研究では、MNP-ICGへのICGの搭載成功率を定量化していません。また、形状の異なる永久磁石の影響下におけるナノ粒子の保持効率を比較していません。さらに、腫瘍組織におけるナノ粒子の保持に対する磁場の長期的な影響も評価していません。
ナノ粒子が大部分を占め、平均サイズは195.4 nmであった。さらに、懸濁液には平均サイズ1176.0 nmの凝集体が含まれていた（図5A）。その後、この部分を遠心フィルターでろ過した。粒子のゼータ電位は-15.69 mVであった（図5B）。
図5 懸濁液の物理的特性：（A）粒子サイズ分布；（B）ゼータ電位における粒子分布；（C）ナノ粒子のTEM写真。
粒子サイズは基本的に200 nm（図5C）で、20 nmの単一のMNPと、電子密度が低いPLA-EDA-ICG結合有機シェルから構成されている。水溶液中での凝集体の形成は、個々のナノ粒子の起電力のモジュラスが比較的低いことによって説明できる。
永久磁石の場合、磁化が体積Vに集中しているとき、積分式は体積と表面積の2つの積分に分けられます。
磁化が一定の試料の場合、電流密度はゼロとなる。この場合、磁束密度ベクトルの式は次のようになる。
数値計算にはMATLABプログラム（MathWorks, Inc.、米国）を使用します。ETU「LETI」学術ライセンス番号40502181。
図7、図8、図9、図10に示すように、最も強い磁場は、円筒の端から軸方向に配置された磁石によって生成されます。有効作用半径は、磁石の形状に相当します。長さが直径よりも大きい円筒形磁石では、最も強い磁場は軸方向-半径方向（対応するコンポーネントの場合）に観測されます。したがって、アスペクト比（直径と長さ）が大きい一対の円筒によるMNP吸着が最も効果的です。
図7 磁石のOz軸に沿った磁束密度Bzの成分。磁石の標準サイズ：黒線0.5×2mm、青線2×2mm、緑線3×2mm、赤線5×2mm。
図8 磁気誘導成分Brは磁石軸Ozに垂直です。磁石の標準サイズ：黒線0.5×2mm、青線2×2mm、緑線3×2mm、赤線5×2mm。
図9 磁石の端軸（z=0）から距離rにおける磁束密度Bz成分。磁石の標準サイズ：黒線0.5×2mm、青線2×2mm、緑線3×2mm、赤線5×2mm。
図10 半径方向の磁気誘導成分。標準磁石サイズ：黒線0.5×2mm、青線2×2mm、緑線3×2mm、赤線5×2mm。
特殊な流体力学モデルを用いることで、腫瘍組織への磁性ナノ粒子（MNP）送達方法の研究、標的領域へのナノ粒子の集中、循環系における流体力学的条件下でのナノ粒子の挙動の解明などが可能となる。外部磁場としては永久磁石を用いることができる。ナノ粒子間の静磁気相互作用を無視し、磁性流体モデルを考慮しない場合、磁石と単一ナノ粒子間の相互作用を双極子-双極子近似で推定すれば十分である。
ここで、mは磁石の磁気モーメント、rはナノ粒子が存在する点の半径ベクトル、kはシステム係数である。双極子近似では、磁石の磁場は同様の構成となる（図11）。
一様な磁場では、ナノ粒子は力線に沿ってのみ回転します。不均一な磁場では、ナノ粒子には次のような力が作用します。
は、与えられた方向 l の導関数です。さらに、力はナノ粒子を場の最も不均一な領域に引き寄せます。つまり、力線の曲率と密度が増加します。
したがって、粒子が存在する領域において、軸方向の異方性が明確な、十分に強力な磁石（または磁石チェーン）を使用することが望ましい。
表1は、単一の磁石が、適用部位の血管床においてMNPを捕捉および保持するのに十分な磁場源として機能する能力を示している。