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細胞増殖抑制剤を標的に送達するために磁性酸化鉄ナノ粒子の動きを制御する
著者 トロポヴァ Y、コロレフ D、イストミナ M、シュルマイスター G、ペトゥホフ A、ミシャニン V、ゴルシコフ A、ポジャチェヴァ E、ガレーエフ K、バグロフ A、デミドフ O
ヤナ・トロポワ,1 ドミトリー・コロレフ,1 マリア・イストミナ,1,2 ガリーナ・シュルマイスター,1 アレクセイ・ペトゥホフ,1,3 ウラジミール・ミシャニン,1 アンドレイ・ゴルシコフ,4 エカテリーナ・ポジャチェワ,1 カミル・ガレーエフ,2 アレクセイ・バグロフ,5 オレグ・デミドフ6,71 アルマゾフ国立医療ロシア連邦保健省研究センター、サンクトペテルブルク、197341、ロシア連邦。2 サンクトペテルブルク電気技術大学「LETI」、サンクトペテルブルク、197376、ロシア連邦。3 個別化医療センター、ロシア連邦保健省アルマゾフ州立医療研究センター、サンクトペテルブルク、197341、ロシア連邦。4FSBI 「AA スモロディンツェフにちなんで命名されたインフルエンザ研究所」ロシア連邦保健省、ロシア連邦サンクトペテルブルク。5 ロシア連邦サンクトペテルブルク、ロシア科学アカデミー、セチェノフ進化生理学・生化学研究所。6 RAS細胞学研究所、サンクトペテルブルク、194064、ロシア連邦。7INSERM U1231、ブルゴーニュ・フランシュ・コンテ大学医学薬学部、ディジョン大学、フランス 連絡先: Yana ToropovaAlmazov National Medical Research Centre、ロシア連邦保健省、サンクトペテルブルク、197341、ロシア連邦 Tel +7 981 95264800 4997069 電子メール[email protected] 背景: 細胞増殖抑制毒性の問題に対する有望なアプローチは、標的薬物送達のための磁性ナノ粒子 (MNP) の使用です。目的: 計算を使用して、生体内で MNP を制御する磁場の最適な特性を決定し、マウス腫瘍への MNP のマグネトロン送達の効率を試験管内および生体内で評価します。（MNPs-ICG）を利用します。腫瘍マウスを用いて、対象部位に磁場を与えた場合と与えない場合の生体内発光強度研究を実施した。これらの研究は、ロシア保健省アルマゾフ国立医学研究センターの実験医学研究所によって開発された流体力学的足場上で実施された。結果: ネオジム磁石の使用により、MNP の選択的蓄積が促進されました。担癌マウスに MNPs-ICG を投与して 1 分後、MNPs-ICG は主に肝臓に蓄積します。磁場の有無にかかわらず、これはその代謝経路を示します。磁場の存在下では腫瘍内の蛍光の増加が観察されましたが、動物の肝臓内の蛍光強度は時間の経過とともに変化しませんでした。結論: このタイプの MNP は、計算された磁場強度と組み合わせることで、腫瘍組織への細胞増殖抑制剤の磁気制御送達の開発の基礎となる可能性があります。キーワード: 蛍光分析、インドシアニン、酸化鉄ナノ粒子、細胞増殖抑制剤のマグネトロン送達、腫瘍標的化
腫瘍疾患は世界中で主な死因の 1 つです。同時に、腫瘍疾患の罹患率と死亡率が増加する傾向は依然として存在します。1 今日使用されている化学療法は、依然としてさまざまな腫瘍に対する主要な治療法の 1 つです。同時に、細胞増殖抑制剤の全身毒性を軽減する方法の開発も依然として重要です。その毒性問題を解決する有望な方法は、ナノスケールの担体を使用して薬物送達法を標的にすることであり、これにより、健康な器官や組織への薬物の蓄積を増加させることなく、腫瘍組織に薬物を局所的に蓄積させることができる。集中。2 この方法により、化学療法薬の全身毒性を軽減しながら、腫瘍組織に対する化学療法薬の効率と標的を改善することが可能になります。
細胞増殖抑制剤の標的送達が検討されているさまざまなナノ粒子の中で、磁性ナノ粒子 (MNP) は、その多用途性を確実にする独特の化学的、生物学的、磁気的特性により特に興味深いものとなっています。したがって、磁気ナノ粒子は、温熱療法 (磁気温熱療法) で腫瘍を治療するための加熱システムとして使用できます。診断薬（磁気共鳴診断）としても使用できます。3-5 これらの特性を利用し、外部磁場の使用による特定領域での MNP 蓄積の可能性と組み合わせて、標的医薬品を送達することで、細胞増殖抑制剤を腫瘍部位に標的化するための多機能マグネトロン システムの構築が可能になります。展望。このようなシステムには、体内の動きを制御するための MNP と磁場が含まれます。この場合、外部磁場と、腫瘍を含む身体領域に配置された磁気インプラントの両方を磁場の発生源として使用できます。6 最初の方法には、薬物を磁気的に標的とするための特殊な機器を使用する必要があることや、手術を行うための人員を訓練する必要があることなど、重大な欠点があります。さらに、この方法はコストが高いため限界があり、体の表面に近い「表面」腫瘍にのみ適しています。磁気インプラントを使用する代替方法は、この技術の適用範囲を拡大し、体のさまざまな部分にある腫瘍への使用を容易にします。個々の磁石と管腔内ステントに組み込まれた磁石の両方を、中空臓器の腫瘍損傷に対するインプラントとして使用して、開存性を確保できます。しかし、私たち自身の未発表の研究によると、これらは血流から MNP を確実に保持できるほど十分な磁性を持っていません。
マグネトロン薬物送達の有効性は、磁性担体自体の特性、および磁場源の特性 (永久磁石の幾何学的パラメータおよび永久磁石が生成する磁場の強度を含む) など、多くの要因に依存します。磁気誘導細胞阻害剤送達技術の開発を成功させるには、適切な磁性ナノスケール薬物担体の開発、その安全性の評価、体内での動きの追跡を可能にする可視化プロトコルの開発が含まれる必要があります。
本研究では、体内の磁性ナノスケール薬物キャリアを制御するための最適な磁場特性を数学的に計算しました。これらの計算上の特性を備えた印加磁場の影響下で血管壁を介して MNP が保持される可能性も、単離されたラット血管で研究されました。さらに、MNP と蛍光剤の複合体を合成し、それらを in vivo で視覚化するためのプロトコルを開発しました。インビボ条件下、腫瘍モデルマウスにおいて、磁場の影響下で全身投与したときの腫瘍組織におけるMNPの蓄積効率が研究されました。
in vitro 研究では参照 MNP を使用し、in vivo 研究では蛍光剤 (インドレシアニン; ICG) を含む乳酸ポリエステル (ポリ乳酸、PLA) でコーティングされた MNP を使用しました。MNP-ICG が含まれる場合は、(MNP-PLA-EDA-ICG) をご利用ください。
MNP の合成と物理的および化学的特性については、他の場所で詳細に説明されています。7,8
MNPs-ICG を合成するために、最初に PLA-ICG コンジュゲートを生成しました。分子量 60 kDa の PLA-D と PLA-L の粉末ラセミ混合物を使用しました。
PLA と ICG は両方とも酸であるため、PLA-ICG コンジュゲートを合成するには、まず PLA 上にアミノ末端スペーサーを合成する必要があります。これにより、ICG がスペーサーに化学吸着するのに役立ちます。スペーサーは、エチレンジアミン (EDA)、カルボジイミド法および水溶性カルボジイミド、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド (EDAC) を使用して合成されました。PLA-EDAスペーサーは以下のように合成される。20 倍モル過剰の EDA と 20 倍モル過剰の EDAC を 2 mL の 0.1 g/mL PLA クロロホルム溶液に加えます。合成は、１５ｍＬのポリプロピレン試験管中で、振盪機上で３００ｍｉｎ －１ の速度で２時間実施した。合成スキームを図 1 に示します。合成スキームを最適化するには、200 倍過剰の試薬を使用して合成を繰り返します。
合成の最後に、溶液を3000min-1の速度で5分間遠心分離して、過剰な沈殿したポリエチレン誘導体を除去した。次いで、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の０．５ｍｇ／ｍＬのＩＣＧ溶液２ｍＬを、２ｍＬの溶液に添加した。撹拌機を３００分 -1 の撹拌速度で２時間固定する。得られた複合体の模式図を図 2 に示します。
200 mg の MNP に、4 mL の PLA-EDA-ICG コンジュゲートを追加しました。LS-220 シェーカー (LOIP、ロシア) を使用して、懸濁液を 300 min-1 の頻度で 30 分間撹拌します。その後、イソプロパノールで３回洗浄し、磁気分離した。UZD-2 超音波分散機 (FSUE NII TVCH、ロシア) を使用して、連続超音波作用下で IPA を懸濁液に 5 ～ 10 分間添加します。３回目のＩＰＡ洗浄後、沈殿を蒸留水で洗浄し、２ｍｇ／ｍＬの濃度で生理食塩水に再懸濁した。
ZetaSizer Ultra 装置 (Malvern Instruments、英国) を使用して、水溶液中で得られた MNP のサイズ分布を研究しました。JEM-1400 STEM 電界放射陰極 (日本電子、日本) を備えた透過型電子顕微鏡 (TEM) を使用して、MNP の形状とサイズを研究しました。
この研究では、円筒形永久磁石 (N35 グレード、ニッケル保護コーティング付き) と次の標準サイズ (長軸長さ × 円筒直径) を使用します: 0.5×2 mm、2×2 mm、3×2 mm、5×2んん。
モデルシステムにおける MNP 輸送の in vitro 研究は、ロシア保健省アルマゾフ国立医学研究センターの実験医学研究所によって開発された流体力学的足場上で実施されました。循環液（蒸留水またはクレブス・ヘンゼライト溶液）の量は225mLです。永久磁石として軸方向に着磁された円筒形磁石が使用されます。磁石を中央のガラス管の内壁から 1.5 mm 離れたホルダー上に置き、その端を管の方向 (垂直) に向けます。閉ループ内の流体流量は 60 L/h (線速度 0.225 m/s に相当) です。クレブス・ヘンゼライト溶液は血漿の類似物であるため、循環液として使用されます。プラズマの動粘性係数は 1.1 ～ 1.3 mPa・s です。9 磁場中での MNP の吸着量は、実験後の循環液中の鉄濃度から分光測光法により求めます。
さらに、血管の相対透過性を測定するために、改良された流体力学テーブルで実験研究が行われました。流体力学的サポートの主なコンポーネントを図 3 に示します。流体力学的ステントの主なコンポーネントは、モデル血管系の断面をシミュレートする閉ループと貯蔵タンクです。血管モジュールの輪郭に沿ったモデル流体の動きは、蠕動ポンプによって提供されます。実験中は、蒸発温度と必要な温度範囲を維持し、システム パラメーター (温度、圧力、液体流量、pH 値) を監視します。
図 3 頸動脈壁の透過性を研究するために使用されるセットアップのブロック図。1-貯蔵タンク、2-蠕動ポンプ、3-MNPを含む懸濁液をループに導入する機構、4-流量計、5-ループ内の圧力センサー、6-熱交換器、7-容器付きチャンバー、8-ソース磁場の影響、9-炭化水素を含む風船。
コンテナを含むチャンバーは、外側の大きなコンテナと 2 つの小さなコンテナの 3 つのコンテナで構成されており、これらのコンテナの中を中央回路のアームが通過します。小さな容器にカニューレを挿入し、容器を小さな容器に紐で結び、カニューレの先端を細い針金でしっかりと結びます。大きな容器と小さな容器の間の空間には蒸留水が満たされており、熱交換器が接続されているため温度は一定に保たれます。小さな容器内の空間は、血管細胞の生存率を維持するためにクレブス・ヘンゼライト溶液で満たされています。タンクにはクレブス・ヘンセライト溶液も充填されています。ガス (炭素) 供給システムは、貯蔵タンク内の小さな容器とその容器を含むチャンバー内の溶液を蒸発させるために使用されます (図 4)。
図 4 コンテナが置かれているチャンバー。1-血管を下げるためのカニューレ、2-外側チャンバー、3-小チャンバー。矢印はモデル流体の方向を示します。
血管壁の相対透過性指数を決定するために、ラットの頸動脈を使用しました。
MNP 懸濁液 (0.5mL) のシステムへの導入の特徴は、ループ内のタンクと接続パイプの合計内容積が 20mL、各チャンバーの内容積が 120mL であることです。外部磁場源は、標準サイズ 2×3 mm の永久磁石です。これは、容器から 1 cm 離れた小さなチャンバーの 1 つの上に、一端が容器の壁に面するように取り付けられます。温度は37℃に保たれています。ローラー ポンプの出力は 50% に設定されており、これは 17 cm/s の速度に相当します。対照として、永久磁石のないセルでサンプルを採取しました。
所定の濃度の MNP を投与してから 1 時間後、チャンバーから液体サンプルを採取しました。粒子濃度は、Unico 2802S UV-Vis分光光度計(United Products & Instruments、米国)を使用した分光光度計によって測定した。MNP 懸濁液の吸収スペクトルを考慮して、測定は 450 nm で実行されました。
Rus-LASA-FELASAのガイドラインによれば、すべての動物は特定の病原体のない施設で飼育され、飼育されています。この研究は、動物実験および研究に関連するすべての倫理規定に準拠しており、アルマゾフ国立医学研究センター (IACUC) から倫理的承認を得ています。動物は水を自由に飲み、定期的に餌を与えた。
この研究は、体重 22 g ± 10% の麻酔をかけた 12 週齢の雄免疫不全 NSG マウス (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj、米国ジャクソン研究所) 10 匹で実施されました。免疫不全マウスは免疫力が抑制されているため、この系統の免疫不全マウスは移植拒絶反応を起こさずにヒトの細胞や組織を移植することが可能です。異なるケージからの同腹子を実験グループにランダムに割り当て、それらを共飼育するか、他のグループの床材に体系的に曝露して、共通の微生物叢に均等に曝露されるようにしました。
HeLa ヒトがん細胞株は、異種移植モデルを確立するために使用されます。細胞は、10％ウシ胎児血清（Hyclone、米国）、100 CFU/mL ペニシリン、および 100 μg/mL ストレプトマイシンを補充したグルタミン（PanEco、ロシア）を含む DMEM 中で培養しました。この細胞株は、ロシア科学アカデミー細胞研究所の遺伝子発現制御研究室のご厚意により提供されました。注入前に、HeLa 細胞を 1:1 トリプシン:Versene 溶液 (Biolot、ロシア) を使用して培養プラスチックから取り出しました。洗浄後、細胞を完全培地に200μLあたり5×106細胞の濃度で懸濁し、基底膜マトリックス（LDEV-FREE、MATRIGEL® CORNING®）（1:1、氷上）で希釈しました。調製した細胞懸濁液をマウスの大腿部の皮膚に皮下注射した。電子ノギスを使用して 3 日ごとに腫瘍の成長を監視します。
腫瘍が 500 mm3 に達したとき、腫瘍近くの実験動物の筋肉組織に永久磁石が埋め込まれました。実験グループ (MNPs-ICG + 腫瘍 M) では、0.1 mL の MNP 懸濁液を注射し、磁場に曝露しました。未処理の動物全体を対照（バックグラウンド）として使用した。さらに、0.1 mLのMNPを注射したが磁石は埋め込まなかった動物(MNPs-ICG + 腫瘍-BM)を使用した。
インビボおよびインビトロサンプルの蛍光視覚化は、IVIS Lumina LT シリーズ III バイオイメージャー (PerkinElmer Inc.、米国) で実行されました。インビトロ視覚化のために、1 mL の合成 PLA-EDA-ICG および MNP-PLA-EDA-ICG コンジュゲートをプレートのウェルに添加しました。ICG 色素の蛍光特性を考慮して、サンプルの発光強度を決定するために使用される最適なフィルターが選択されます。最大励起波長は 745 nm、発光波長は 815 nm です。Living Image 4.5.5 ソフトウェア (PerkinElmer Inc.) を使用して、コンジュゲートを含むウェルの蛍光強度を定量的に測定しました。
MNP-PLA-EDA-ICG コンジュゲートの蛍光強度と蓄積は、対象部位に磁場の存在や印加を行わずに、in vivo 腫瘍モデル マウスで測定されました。マウスをイソフルランで麻酔し、0.1 mLのMNP-PLA-EDA-ICG複合体を尾静脈から注射した。未処理のマウスをネガティブコントロールとして使用し、蛍光バックグラウンドを取得しました。複合体を静脈内投与した後、2% イソフルラン麻酔で吸入を維持しながら、IVIS Lumina LT シリーズ III 蛍光イメージャー (PerkinElmer Inc.) のチャンバー内の加熱ステージ (37°C) に動物を置きます。MNP 導入後 1 分および 15 分の信号検出には、ICG の内蔵フィルター (745 ～ 815 nm) を使用します。
腫瘍内の結合体の蓄積を評価するために、動物の腹膜領域を紙で覆い、肝臓内の粒子の蓄積に伴う明るい蛍光を除去することができました。MNP-PLA-EDA-ICG の体内分布を研究した後、その後の腫瘍領域の分離と蛍光放射線の定量的評価のために、過剰量のイソフルラン麻酔によって動物を人道的に安楽死させました。Living Image 4.5.5 ソフトウェア (PerkinElmer Inc.) を使用して、選択した関心領域からの信号分析を手動で処理します。各動物について 3 回の測定を行った (n = 9)。
この研究では、MNPs-ICG への ICG のロード成功率は定量化しませんでした。さらに、異なる形状の永久磁石の影響下でのナノ粒子の保持効率を比較しませんでした。さらに、我々は腫瘍組織におけるナノ粒子の保持に対する磁場の長期的な影響を評価しなかった。
ナノ粒子が大半を占め、平均サイズは 195.4 nm です。さらに、懸濁液には平均サイズ 1176.0 nm の凝集体が含まれていました (図 5A)。続いて、遠心フィルターで濾過した。粒子のゼータ電位は -15.69 mV です (図 5B)。
図 5 懸濁液の物理的特性: (A) 粒度分布。(B) ゼータ電位における粒子分布。(C) ナノ粒子の TEM 写真。
粒子サイズは基本的に 200 nm (図 5C) で、サイズ 20 nm の単一 MNP と、電子密度が低い PLA-EDA-ICG 共役有機シェルで構成されています。水溶液中での凝集体の形成は、個々のナノ粒子の起電力の係数が比較的低いことで説明できます。
永久磁石の場合、磁化が体積 V に集中している場合、積分式は体積と表面の 2 つの積分に分割されます。
磁化が一定のサンプルの場合、電流密度はゼロです。この場合、磁気誘導ベクトルの表現は次の形式になります。
数値計算には MATLAB プログラム (MathWorks, Inc., USA) を使用します。ETU「LETI」アカデミック ライセンス番号 40502181。
図 7、図 8、図 9、図-10 に示すように、最も強い磁場は、円筒の端から軸方向に向けられた磁石によって生成されます。有効作用半径は磁石の形状に相当します。長さが直径よりも大きい円筒を備えた円筒形磁石では、最も強い磁場が軸方向と半径方向に観察されます (対応するコンポーネントの場合)。したがって、より大きなアスペクト比（直径と長さ）を備えた一対のシリンダーが MNP を吸着するのが最も効果的です。
図7 磁石のOz軸に沿った磁気誘導強度Bzの成分。マグネットの標準サイズ：黒線0.5×2mm、青線2×2mm、緑線3×2mm、赤線5×2mm。
図 8 磁気誘導成分 Br は磁石軸 Oz に対して垂直です。マグネットの標準サイズ：黒線0.5×2mm、青線2×2mm、緑線3×2mm、赤線5×2mm。
図 9 磁石の端軸からの距離 r における磁気誘導強度 Bz 成分 (z=0)。マグネットの標準サイズ：黒線0.5×2mm、青線2×2mm、緑線3×2mm、赤線5×2mm。
図 10 半径方向に沿った磁気誘導成分。標準マグネットサイズ：黒線0.5×2mm、青線2×2mm、緑線3×2mm、赤線5×2mm。
特別な流体力学モデルを使用して、腫瘍組織への MNP 送達方法を研究し、標的領域にナノ粒子を集中させ、循環系における流体力学条件下でのナノ粒子の挙動を決定することができます。永久磁石は外部磁場として使用できます。ナノ粒子間の静磁気相互作用を無視し、磁性流体モデルを考慮しない場合は、双極子間近似を使用して磁石と単一のナノ粒子の間の相互作用を推定するだけで十分です。
ここで、m は磁石の磁気モーメント、r はナノ粒子が配置されている点の半径ベクトル、k はシステム係数です。双極子近似では、磁石の磁場は同様の構成になります (図 11)。
均一な磁場では、ナノ粒子は力線に沿ってのみ回転します。不均一な磁場では力が作用します。
ここで、 は指定された方向 l の導関数です。さらに、この力はナノ粒子をフィールドの最も不均一な領域に引き込みます。つまり、力線の曲率と密度が増加します。
したがって、粒子が位置する領域に明らかな軸異方性を備えた十分に強力な磁石 (または磁石チェーン) を使用することが望ましいです。
表 1 は、適用領域の血管床に MNP を捕捉して保持するのに十分な磁場源としての単一磁石の能力を示しています。